超顺磁性氧化铁纳米粒子标记心脏内骨髓间充质干细胞及活体磁共振

添加日期：2010年5月6日 阅读：2008

　　急性心肌梗死是冠心病中*危险的疾病类型，目前通过干细胞移植促进心肌细胞再生和血管新生，成为心血管疾病治疗的一大热点。干细胞在体内迁移、增殖和分化等生物学变化是影响疗效的重要因素，但目前对体内干细胞定量、定位及追踪其转归还比较困难。本实验通过MRI检查对移植入体内超顺磁性氧化铁纳米粒子（superparamaganeticironoxidenanoparticles，SPIO）标记的骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）进行活体示踪，探讨该方法能否作为一种无创的手段来示踪心脏内干细胞的迁移和转归。
　　
　　１材料与方法
　　
　　１．１主要试剂和设备２周龄雄性SD大鼠（８０～１００g，上海动物实验中心），L-DMEM培养基、胎牛血清、胰酶（GIBCO公司），FITC-CD９０、FITC-CD４５（Serotec公司），SPIO（上海交通大学纳米技术研究院），cm-DiI（invitrogen公司），倒置光学显微镜（Leica公司），流式细胞仪（Beckman公司），酶标仪（ZD-Ⅱ型，Labsystem公司），动物呼吸机（上海嘉鹏科技公司），磁共振３．０T（美国GE公司）。
　　
　　１．２方法
　　
　　１．２．１MSCs的分离、培养大鼠颈椎脱臼处死，取股骨、胫骨，用L-DMEM培养液冲洗骨髓腔收集骨髓细胞，１５００r／min离心５min，细胞沉淀加入含１０％胎牛血清（含青霉素１００U／L、链霉素１００mg／L）的L-DMEM吹打成细胞悬液，接种于培养瓶，３７℃、５％CO２培养箱中培养。采用贴壁筛选法，２４h**换液，以后每３d更换培养液，当８０％～９０％细胞铺满瓶底时，胰酶消化细胞后１∶２传代。
　　
　　１．２．２细胞标记取第５代（P５）MSCs，SPIO（７５μg／mL）标记２４h后普鲁士蓝染色观察标记率。
　　
　　１．２．３MTT法测定SPIO对标记细胞活性的影响SPIO标记的MSCs培养至２d，胰酶消化后接种至９６孔培养板，对照组为未标记细胞，每组各１０孔。每孔加MTT溶液（５mg／mL），４h后加DMSO１５０μL／孔，酶标仪（波长５７０nm）测OD值。SPIO标记培养至１５d再作MTT。
　　
　　１．２．４建立急性心肌梗死大鼠模型大鼠麻醉后行气管插管。胸骨旁左侧做纵切口，钝性分离各层肌肉，开启呼吸机（呼吸频率５０次／min，潮气量４０mL），剪断第４肋骨，暴露心脏，结扎左前降支。
　　
　　１．２．５细胞移植及分组实验动物为磁性细胞移植组、纳米粒子移植组和非磁性细胞移植组，每组８只；分别在心肌梗死边缘区注射SPIO标记的MSCs、SPIO溶液（铁浓度５０μg／mL）、未标记的MSCs，每只动物４个注射点，共１００μL（３×１０６细胞）。
　　
　　１．２．６MR显像术后３、７、１４、２１d行MRI检查。采用心电门控技术，T１显像采用SE序列，扫描时间２min３９s，TE１０ms，TR５００ms，带宽３１．２５，层厚１．５mm，层间距０．０mm，矩阵２５６×１２８，视野１２cm×１２cm，NEX２．０；T２显像采用FRFSE序列，扫描时间７min１５s，TR１５００ms，TE３１ms，层厚１．５mm，层间距０．０mm，矩阵１２８×１２８，NEX２４．００，带宽２０．８３，视野１２cm×１０cm，回波链长度９，从心尖至心底一共扫描９～１０层。
　　
　　１．２．７组织学检查术后３周处死动物，取左心室，固定、脱水、透明、石蜡包埋。冠状切片作HE染色、普鲁士蓝染色。
　　
　　１．３统计学分析SAS８．０统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较用方差分析、t检验。P＜０．０５为差异有统计学意义。
　　
　　2结果
　　
　　２．１细胞标记率随机计数１０个视野，SPIO标记的MSCs经普鲁士蓝染色后胞浆内可见蓝色铁颗粒，标记阳性率达９５％（图１）。
　　
　　２．２SPIO对MSCs活性的影响MTT法测定SPIO标记MSCs后２、１５d与未标记的MSCs（对照组）的OD值比较差异无统计学意义（２dP＝０．０９６，１５dP＝０．３５７）。
　　
　　２．３MRI显像结果（１）大鼠梗死部位心肌（包括梗死边缘区）T１像信号降低，但不明显；T２像信号明显增强。SPIO标记的MSCs在T２像呈低信号（灰色或黑色）（图２A），与周围梗死心肌高信号比较而能识别，在T１像不能辨认。（２）磁性细胞移植组术后３、７、１４d能在MRIT２像清楚显示的注射点分别为６５．６％、５６．３％、１８．８％（表现为T２像低信号区），显影动物数分别为８、８、５只。至术后第３周不能显示低信号的注射点。随时间的**，低信号区域由边界清楚向边缘模糊改变，低信号区域范围有扩大趋势至*后的消失，信号对比度也随之降低（图２A～D）。在T１像无法辨认磁性细胞移植组的移植细胞，且非磁性细胞移植组、纳米粒子移植组在第３、７、１４、２１天均未能在T１、T２像检测到所移植的细胞或纳米粒子。
　　
　　２．４组织学检查磁性细胞移植组组织切片经普鲁士蓝染色后镜下可见梗死区（图３A）有胞浆含有蓝色铁颗粒的移植细胞，而纳米粒子移植组未见蓝色铁颗粒的纳米粒子（图３B）。
　　
　　３讨论
　　
　　干细胞移植后在受体中观察其迁移和转归一直是让人困扰的问题。其中MRI成像时间较长，可观察细胞的动态迁徙过程，空间、时间分辨率高，对比度好，可以活体示踪移植细胞，因而被广泛应用。SPIO是一种新型的MRI对比剂，能显著增强T２弛豫效能，在磁共振T２像呈低信号（灰色或黑色），因而能被检测到［１］。SPIO磁敏感性较高，对细胞**性，基本不影响干细胞的活性及增殖和分化能力［２－４］，并且被细胞代谢后能进入正常血浆铁池，与红细胞血红蛋白结合［５］，并在调理素作用下被网状内皮系统识别、吞噬细胞摄取。本实验中SPIO平均直径３０～４０nm，表面包被葡聚糖，以７５μg／mL铁浓度孵育能有效标记MSCs达９５％。MTT法结果发现SPIO标记后第２、１５天MSCs活性正常，与以往研究结果相同。
　　
　　本研究发现磁性细胞移植组术后３、７、１４d在MRIT２像清楚显示的注射点分别为６５．６％、５６．３％、１８．８％，至术后３周不能显示低信号注射点。随时间的**，低信号区域由边界清楚向边缘模糊改变，低信号区域范围有扩大趋势至*后的消失，信号对比度也随之降低。这说明超顺磁性Fe３O４纳米粒子可以作为示踪剂在磁共振下对移植入心肌梗死周边区的MSCs进行早期体内示踪。
　　但本研究中移植后３d有约３５％的注射点未能显影，这可能与这些注射点细胞数较少有关。１周后低信号区域对比度下降可能由于MSCs分裂及迁移所致，使单位像素内的铁浓度下降［６］。Kraitchman等［６］认为干细胞死亡后被巨噬细胞清除也导致对比度下降。
　　
　　但本研究发现MSCs死亡后释放的SPIO可能更多地进入血液循环被代谢掉，而不是被其他细胞（如巨噬细胞）所吞噬。因为本研究中发现纳米粒子移植组的心肌组织经普鲁士蓝染色未见蓝色铁粒子，说明SPIO直接注射入心肌后大部分进入了血液循环而不是被巨噬细胞或其他细胞所吞噬。
　　
　　本实验证实SPIO可以作为示踪剂在磁共振下对移植入梗死边缘区的MSCs进行体内追踪，该方法可作为一种无创的手段来示踪体内干细胞的迁移及转归。但实验对象为小动物，有所不足，日后可以对大动物进行更深入的研究。

        责任编辑：小徐     WWW.1168.TV    2010-5-6 9:21:51

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